时间：2024-07-30 15:21
在健康足月新生儿中，感音神经性耳聋的发生率估计在每1000名活产儿中有1至3人，并且在至少50%的病例中遗传因素起着关键作用。常见的导致常染色体隐性非综合征性耳聋的基因有GJB2、GJB6、OTOF以及STRC、TMC1、TMPRSS3、ILDR1、CAPB2、SYNE4、TMHS 和MSRB3等，这些基因突变都会导致不同程度的听力损失。目前，通过助听器或耳蜗植入（适用于重度至极重度听力损失，使用助听器无法获益的情况）来恢复听觉功能是唯一能够减轻由此导致听力损失的方法。
最近的研究强调了遗传性耳聋的复杂性，并试图开发新的非假体治疗方法来解决这些问题。因此，目前正在开发非病毒和病毒递送治疗方法。
基因替代疗法是一种治疗遗传性听力损失很有前景的方法，该方法利用病毒载体递送有功能的cDNA来"替代"内耳功能失调细胞中的缺陷基因。概念验证研究已经成功地使用这种方法改善了遗传性耳聋小鼠模型的听觉功能。内耳是基因治疗的一个很好的候选部位，原因如下：（1）通过微创手术很容易接触到耳蜗；（2）在解剖学上相对独立，允许简单而直接地进行基因治疗；（3）局部应用是在相对免疫保护的环境中进行的；（4）器官内部充满液体，从而允许递送基因的广泛扩散。
动物研究表明，利用重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus，rAAV )介导的基因治疗至少可以部分恢复由基因突变或缺失引起的遗传性耳聋。对天然 AAV 血清型的初步鉴定发现，内耳细胞类型和外毛细胞的转导率相对较低。然而，最近开发的合成 AAV 衣壳似乎已经克服了这一障碍，例如AAV9-PHP.B 已被证明能够在小鼠和非人灵长类动物中以高速率转导内毛细胞（IHC）和外毛细胞。作为一种临床治疗的“明星载体”，AAV似乎有望在耳聋治疗的临床研究中得到广阔应用。
（一）OTOF基因（DFNB9）
负责产生耳畸蛋白（Otoferlin）的OTOF基因是导致非综合征型隐性感音神经性耳聋的一个重要因素。目前已发现超过160种OTOF突变，大多数患者在语言习得前经历了稳定的、重度到极重度的听力损失。OTOF也被认定为是非综合征型隐性听神经病谱系障碍的首要病因。OTOF主要在耳蜗内毛细胞中表达，其中Otoferlin蛋白在突触囊泡的外排中起着至关重要的作用。具体来说，Otoferlin蛋白对于突触内毛细胞中的谷氨酸释放至关重要，而OTOF基因发生突变时会导致常染色体隐性耳聋9型（DFNB9）。
四项临床前研究发现在OTOF基因小鼠敲除模型中通过AAV基因治疗可以恢复听力。由于标准AAV（<4.7kb）的包装容量有限，一些大基因编码序列（如OTOF约~6kb）的递送并不简单。这种包装问题已经在DFNB9小鼠模型的临床前基因替代试验中通过两种方法得到了解决：双AAV和AAV超载。
双AAV模型，将携带5′和3′编码序列片段的两个不同AAV在IHC内部重新组合。Al-Moyed 等证明，使用双 rAAV 策略在IHC中重新组装完整的otoferlin蛋白cDNA，可恢复新生 Otof−/− 小鼠的胞吐作用和部分听觉功能。Akil等使用相同的双rAAV方法，在接受治疗的新生小鼠和年轻成年小鼠（P30）中实现了完全的听力恢复。Rankovic等通过将全长OTOF编码序列封装到单个AAV载体中来探索AAV超载模型。将超载的AAV注射到早期OTOF-KO小鼠的耳蜗中，导致约30%的IHCs中有otoferlin蛋白的特异性表达。通过听觉脑干反应记录和行为测试证实这种方法能导致部分听力的恢复。在另一项研究中，提出了一种基于蛋白质反式剪接的新型双AAV介导的基因治疗系统。这个系统在单侧注射后，有效地逆转了OTOF−/−小鼠的双侧耳聋。在至少6个月的时间里，观察到内部毛细胞的听觉能力和突触小泡释放的恢复。
（二）GJB2 (DFNB1)
非综合征型常染色体隐性遗传性耳聋表现出遗传多样性，但很大一部分病例（高达50%）可归因于染色体13q11 - 12上的单一基因座，即DFNB1。与DFNB1相关的基因是GJB2，它编码缝隙连接蛋白26，这是一种负责在细胞之间创建通道的间隙连接蛋白，该蛋白在维持Corti器官内的钾离子稳态和促进细胞间信号传导方面发挥着至关重要的作用。随着时间的推移，还发现了其他突变，包括GJB6和GJB3中的许多突变，它们分别编码连接蛋白30和连接蛋白31。GJB2仍然是常染色体隐性遗传性感音神经性耳聋最常见的形式，也是许多遗传性耳聋人群中最常见的原因。临床上，它表现为双侧重度感音神经性耳聋，传统上用人工耳蜗治疗。
几项临床前体外和体内研究，如Crispino等的研究表明，通过使用AAV载体，有可能恢复GJB2敲除小鼠耳蜗中连接蛋白26的表达并恢复缝隙连接的功能。在Yu等进行的一项研究中，在体内观察到耳蜗非感觉细胞之间强大的间隙连接细胞间网络的恢复。这种恢复是通过将病毒介导的基因治疗接种到GJB2基因敲除小鼠的scala培养基中实现的。在另一种试图建立GJB2损伤较轻的动物模型的尝试中，Guo等建立了可诱导的Sox10iCreERT2介导的GJB2缺失的小鼠模型。这些小鼠是研究连接蛋白26在耳蜗中作用的有价值的工具，可用于评估基因治疗载体和开发GJB2相关耳聋的治疗方法。
尽管最近有临床前研究显示在GJB2基因敲除小鼠中连接蛋白26和间隙连接功能得到恢复，但只有Takashi等的一项研究显示在接受AAV基因治疗后，敲除GJB2动物模型中出现了听力改善的信号。使用由Protein 0（P0）启动子控制的条件方法开发了内耳中特定基因缺失的小鼠模型，该研究旨在探讨转录靶向AAV载体将Connexin 26递送到GJB2缺陷新生小鼠耳蜗的有效性和特异性。结果表明，AAV基因治疗成功地实现了Connexin26在Corti器官的非感觉细胞中的有效表达。此外，当在新生儿阶段进行治疗时，听力功能评估证明了该治疗能够预防重度耳聋的进展。
似乎干预时间对于预防GJB2敲除小鼠发展为深度耳聋至关重要；在Takashi等的研究中，AAV基因治疗是在新生儿期进行的，而在Yu等和Guo等的研究中AAV基因疗法是在出生后条件性GJB2基因敲除小鼠中进行的，听觉脑干反应未显示听力改善的迹象。三项条件性GJB2敲除小鼠模型的独立研究表明，在听力开始前，Connexin 26在出生后的Corti器官成熟和维持过程中发挥着关键作用。
（三）TMPRSS3 (DFNB8)
TMPRSS3是II型跨膜丝氨酸蛋白酶家族的成员之一，是一种主要位于螺旋神经节、血管纹和Corti器官上皮的神经元体中的酶。它具有低密度脂蛋白受体A类和清除剂受体富含半胱氨酸的结构域。虽然TMPRSS3的具体功能尚不清楚，但它被认为是通过调节ENaC的活性参与机械电转导，ENaC是一种对阿米洛利敏感的钠通道。
这种调节反过来又会影响耳蜗钠离子浓度。TMPRSS3是听力开始时耳蜗毛细胞存活和激活的关键因素。TMPRSS3突变可导致两种不同的表型：语前聋（DFNB10）和语后迟发性聋（DFNB8）。到目前为止，已经确定了导致DFNB8/10型耳聋的各种突变。虽然大多数受影响的个体都会经历重度至极重度的听力损失，但发病年龄、严重程度和进展速度可能会有所不同，而且基因型和表型之间没有明确的相关性。最近，一项研究证明，单次给予AAV-TMPRSS3基因治疗后，人类DFNB8耳聋的老年小鼠的听力得到了挽救。为了模拟在人类DFNB8患者中观察到的迟发性进行性听力损失，建立了具有与DFNB8相关的常见TMPRSS3突变敲除小鼠模型。使用AAV2作为载体递送人TMPRSS3基因，将AAV2-hTMPRSS3注射到平均年龄18.5个月大的成年敲除小鼠的内耳中，导致毛细胞和螺旋神经节神经元中TMPRSS3的表达，从而导致它们的存活。此外，单次注射AAV2-hTMPRSS3导致听觉功能的持续恢复，与野生型小鼠相当。
（四）STRC (DFNB16)
Stereocilin（STRC）基因，也称为DFNB16，被认为是导致双侧轻度至中度感音神经性听力损失的重要因素。STRC基因突变是常染色体隐性非综合征性耳聋的第二常见原因，在影响感觉毛细胞的遗传性听力损失中尤为常见。STRC基因表达特异于感觉毛细胞，并与立体纤毛密切相关，立体纤毛是刚性微绒毛，形成了负责检测声音刺激的框架。
值得注意的是，立体纤毛蛋白和耳蜗纤毛蛋白在其C末端序列上有相似之处，这表明它们可能参与将盖膜固定到Corti器官的细胞结构上。功能性立体纤毛使耳蜗放大器能够将听觉阈值提高60 dB，从而将对微弱声音的敏感性提高一百万倍。为了开发STRC相关听力损失患者的基因治疗策略，Shubina Oleinik等创建了一个STRC基因靶向缺失的小鼠模型。他们还设计了一种双载体蛋白质重组方法，使用AAV9-PHP衣壳取代DFNB16小鼠外毛细胞中的全长野生型STRC。由于STRC编码序列的大尺寸（5430bp）无法适应单个AAV载体，因此采用了利用整合素介导的蛋白质重组的双载体策略。在出生后的第一周进行载体注射，导致50%的治疗小鼠恢复了DPOAE和ABR阈值。这种恢复在注射后持续了12周，这是测试的最新时间点。虽然STRC突变会导致顶部连接物的丢失、毛束形态紊乱以及毛束与覆盖膜分离，但这项研究表明，与其他听力损失突变不同，STRC突变不会导致早期毛细胞死亡。这些发现表明，如果STRC突变的人类也存在类似的毛细胞死亡缺失，那么DFNB16患者的临床干预可能有一个广阔的时间窗口
（五）TMC1 (DFNB7)
TMC1在小鼠和人类的听觉功能中起着至关重要的作用。它起到机械感觉转导通道的作用，将声音的机械刺激转化为听觉电信号。研究表明，TMC1在人类胎儿耳蜗、小鼠耳蜗内外毛细胞以及前庭器官的神经感觉上皮中表达。已在人类中发现引起耳聋的TMC1突变，占遗传性听力损失病例的很大一部分。这些突变可导致重度至极重度的听力损失，其中一个特定突变c.100C>T（p.R34X）在常染色体隐性非综合征性听力损失中特别常见。几项临床前研究调查了AAV基因疗法在TMC1突变的小鼠模型（DFNB7和DFNB11）中挽救听力损失的能力。例如，Marcovich等证明了注射AAV9-PHP.B-CB6-hTMC1-WPRE的小鼠听觉功能持久恢复，在听觉脑干反应、畸变产物耳声发射、细胞存活和生物分布方面显示出良好的结果。Wu等的另一项研究侧重于使用AAV9-PHP.B向不同的TMC1缺陷小鼠模型递送TMC1基因替代物，以评估听力恢复的程度。研究发现将AAV9-PHP.B注射到胞囊中时，可以有效地沿着耳蜗转导内毛细胞和外毛细胞，从而改善听力恢复并减少细胞死亡。在病毒载体方面，Askew等确定AAV2/1与鸡β-肌动蛋白启动子结合是驱动外源性TMC1在内毛细胞中表达的有效组合。他们证明外源性TMC1和TMC2可以恢复失聪小鼠的感觉转导、听觉脑干反应和听觉惊吓反射。然而，AAV2/1载体在恢复细胞功能方面的有效性仅限于内毛细胞，并未延伸到外毛细胞。为了解决这一限制，Nist-Lund等筛选了各种病毒衣壳，发现了一种合成的AAV.Anc80L065，它能有效地转导内毛细胞和外毛细胞。他们观察到，与AAV2/1载体相比，使用Anc80L065衣壳注射sAAV-Tmc1的小鼠的听觉阈值显著提高。Yeh等研究了由特定TMC1突变引起的隐性听力损失小鼠模型（Baringo小鼠）中的AAV基因治疗。他们利用优化的胞嘧啶碱基编辑器和引导RNA来纠正培养的Baringo衍生的小鼠细胞中的致病突变，并成功恢复了内毛细胞的感觉转导，保留了毛细胞形态，并部分挽救了体内听觉功能。
结论：
近年来，多项研究提供了证据，证明针对内耳的基因替代疗法可以有效增强遗传性听力损失小鼠模型的听觉功能。如本综述所示，不同的临床前研究针对导致常染色体隐性SNHL的特异性DFNB基因突变，并证明了不同水平的听力恢复。编码内耳发育和功能中具有特定和复杂规则的不同蛋白质的基因的几种突变已成为基因治疗临床前计划的靶点；对于某些病例，如GJB2基因，需要更宽的治疗窗口，并且基因治疗直接与临床相关并转化为人类的潜力可能有限。这是因为在许多形式的遗传性耳聋中，感觉上皮和神经元的退化可能在子宫内发育的早期阶段就已发生。因此，出生后靶向毛细胞或螺旋神经节神经元可能不会产生显著的治疗益处。感音神经性听力损失（SNHL）的基因治疗主要集中在出生后存在的耳蜗细胞上，大多数啮齿类动物的基因传递研究都是在毛细胞退化发生之前的新生小鼠进行的。然而，在成年转基因小鼠中进行基因递送也取得了有希望的结果，导致听力受损的部分恢复。正如在OTOF突变中观察到的那样，在毛细胞退化之前进行这种方法已显示出成功，其中耳蜗结构保持不变。我们通过官方clinicaltrials.gov注册发现，目前有三项临床研究在人类中测试AAV基因疗法，特别是在被诊断为双等位基因OTOF突变引起的感音神经性听力损失的患者中。
近期，中国首次在《自然医学》杂志发表耳聋基因治疗方面的创新成果。该研究由复旦大学附属眼耳鼻喉科医院、国家卫健委听觉医学重点实验室的李华伟教授、舒易来教授、王武庆教授团队领衔，联合哈佛大学医学院陈正一教授，利用基于AAV的双载体基因置换疗法（AAV1-hOTOF），使5名聋哑患儿双耳听力均得到明显恢复，言语功能和声源定位能力也得到改善。这些聋哑患儿均为耳畸蛋白缺陷（OTOF基因突变）导致的先天性耳聋，年龄最大的11岁，最小的1岁。随访期间展示出良好的安全性。展示了AAV1-hOTOF药物双耳基因治疗安全有效。
以上表明显示基于AAVs的基因治疗可以成为治疗遗传性耳聋的一种新方法，但对大多数突变进行完整有效的临床转化的道路仍然很漫长。
参考文献：
[1]Brotto D, Greggio M, De Filippis C, Trevisi P. Autosomal Recessive Non-Syndromic Deafness: Is AAV Gene Therapy a Real Chance? Audiol Res. 2024 Feb 22;14(2):239-253. doi: 10.3390/audiolres14020022. PMID: 38525683; PMCID: PMC10961695.
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